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本试剂盒是专门针对长链非编码RNA(lncRNA)反转录而开发的产品。与mRNA相比，lncRNA具有丰度低、GC含量差异大、二级结构更复杂等特性，传统反转录试剂对lncRNA难以达到理想的效果。本试剂盒含有高效去除基因组DNA的gDNase，通过42℃，3min即可去除RNA样品中残留的基因组DNA，可有效避免残留的基因组DNA对后续PCR检测结果的干扰。本试剂盒中lnR RT Enzyme Mix中使用的反转录酶为QuickKing RT Enzyme，此酶是通过分子改造后的新型反转录酶，特别增加了疏水motif，具有更强的RNA亲和性和热稳定性，从而进一步提高了其反转录效率和反应速率，42℃、15min即可完成cDNA第一链的合成，且反转录长度至少可达10kb。另外，新型酶与RNA亲和力的更强，配合特殊优化过的缓冲体系和引物体系，使本试剂盒在通读GC含量高，二级结构复杂，低丰度的RNA模板和抗逆性等方面表现突出，特别适合表达水平相对较低，二级结果相对复杂的lncRNA的反转录反应。

• 性能卓越：反转录效率可达95%以上，Total RNA最低检测下限可达10ng，反转录长度可达10kb以上。
  
• 简单快速：反应体系配制简单，21min完成lncRNA cDNA第一链的合成；
  
• 适用广泛：能够通用于GC含量差异大，二级结构复杂，低丰度的RNA模板；对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高；
  
• 兼容性好：后续配合荧光定量检测产品，灵敏度高、稳定性好。

• 下列操作步骤适用于模板量为10ng～2μg的Total RNA，如果Total RNA量大于2μg，请按比例扩大反应体系。
  
• 在冰上进行操作，防止RNA发生降解。
  
• 对于二级结构很复杂的RNA模板，推荐使用变性步骤，即在操作步骤之前，将模板RNA在65℃孵育5min后迅速转移到冰上，然后再进行下一步操作。
  
• 根据实验需求不同，也可以选用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer，引物使用量：
  Oligo-dT Primer 50pmol/20μL反应体系，
  Gene Specific Primer 5pmol/20μL反应体系。
  
• 当PCR反应有非特异性扩增时，将反转录温度升到50℃会有改善。

• 将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、lnR-RT Primer Mix、10×lnR RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室温（15～25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
  注意：以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
  
• 按下表的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
  

  组分	用量	终浓度
  Total RNA	10ng～2μg
  5×gDNA Buffer	2μL	1×
  RNase-Free ddH2O	补至10μL

  
  
• 按下表的反转录反应体系配制混合液。
  

  组分	用量	终浓度
  10×lnR RT Buffer	2μL	2×
  lnR RT Enzyme Mix	1μL	-
  lnR-RT Primer Mix	2μL	-
  RNase-Free ddH2O	补足到10μL	-

  
  
• 将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀后即完成20μL反应体系。
  
• 42℃，孵育15min。
  
• 95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。
  注：
  
  • 若后续实验为实时荧光定量PCR，反转录产物的加量应不超过PCR体系终体积的1/10，例如50μL的PCR反应体系，反转录产物的加量应不超过5μL。
    
  • 反转录结束后，请将反转录产物置于冰上，再进行后续PCR反应配制；如果需要长时间保存，请置于-20℃。

• 模板的完整性：模板RNA的完整性对反转录非常重要，若RNA模板中含有RNase酶将降解模板RNA，最后导致cDNA产物的量少甚至无cDNA产物。
  
• 模板的纯度：若RNA模板中含有蛋白、盐离子、EDTA、乙醇、酚等杂质，将影响反转录酶的活性，最后影响反转录结果。
  
• 模板的加量：上述操作步骤适用于模板RNA量为10ng～2μg，如果模板RNA的量大于2μg，请按比例扩大反应体系。